Forskning ved Københavns Universitet - Københavns Universitet

Forside

Downstream events of neurogenin 3 in pancreatic endocrine differentiation

Publikation: Bog/antologi/afhandling/rapportPh.d.-afhandlingForskning

  • Louise Christiane Rosenberg Christ
Mere end 170 millioner mennesker har diabetes og en prognose viser at dette tal forventes at stige over de næte 30 år. I Danmark er forekomsten fordoblet fra 1996 til 2007, hvor 240.000 mennesker havde diabetes. Diabetes er manifestationen af en unormal blodsukker regulering, som kan have flere årsager. De hyppigst forekommende typer skyldes enten en autoimmun ødelæggelse af de insulin-producerende ß-celler i bugspytkirtlen (type 1) eller en kombination af insulin resistens i vævene og en utilstrækkelig ß-celle funktion (type 2). I begge tilfælde kommer det til udtryk som forhøjet blodsukker.
Viden om hvordan bugspytkirtlen dannes og om mekanismerne bag differentieringen af bugspytkirtlens tidlige celler til modne hormonproducerende ß-celler håber man at kunne overføre til stamcelleforskningen. Det er målet at blive i stand til at inducere stamceller til at differentiere til insulin producerende celler på en kontrolleret måde. Håber er, at en produktion af ß-celler i kombination med en protokol for transplantation af disse til mennesker vil give diabetes patienter mulighed for at opnå normal blodsukkerregulering, mindske risikoen for senkomplikationer og at frigøre dem for insulin indsprøjtningerne flere gange om dagen.
Udviklingsbiologiske undersøgelser af bugspytkirtlen har afsløret at udtrykket af transkriptionsfaktoren Neurog3 er en nøglebegivenhed i bugspytkirtlens udvikling. Neurog3 inducerer endokrin differentiering og er nødvendig for udviklingen af hele den endokrine del af bugspytkirtlen, der udgøres af de hormonproducerende celler i de Langerhanske øer. De begivenheder der følger umiddelbart nedenstrøms for Neurog3 ekspression er imidlertid uklare. Formålet med denne afhandling var at undersøge disse begivenheder nærmere. Vi foretog en deletionsanalyse af Neurog3 og karakteriserede de trunkerede Neurog3 proteiner mht. deres lokalisering i cellen, DNA-bindende egenskaber, aktivitet in vitro og in vivo ved at benytte in ovo elektroporation. Desuden blev betydningen af bindingspartneren E12 undersøgt i forbindelse med Neurog3s funktion. Mutationer i det menneskelige Neurog3 blev undersøgt for deres DNA-bindende egenskaber og for effekten af E12 på deres funktion in vivo. Endelig blev transkriptionsfaktoren MyT1 undersøgt, som et muligt direkte mål for Neurog3.
Undersøgelserne af de trunkerede Neurog3 proteiner viste, at et intakt bHLH domæne og de aminosyrer, der flankerer bHLH domænet på den N-termiale side, har betydning for kernelokalisering af Neurog3, da de proteiner der manglede den N-terminal ende eller med et trunkeret bHLH domæne var til stede i cytoplasma i højere grad end vildtypen.

Det N-terminal domæne var ikke nødvendigt for at Neurog3 kunne inducere transskription fra Neurod1 promotoren i samme grad som vildtypen, og proteinet der manglede det N-terminale domæne bandt bedre end vildtypen til DNA. Trunkering fra den C-terminale ende reducerede Neurog3s transskritpionsaktivitet fra Neurod1 promotoren. Selv Neurog3 proteinerne med meget lav in vitro aktivitet var i stand til at inducere differentiering af glukagonproducerende celler, migration og sammenklumpning in vivo. Det Neurog3 protein, der manglede det N-terminale domæne, var overraskende nok i stand til at inducere ectopisk insulinproduktion i endodermen af kyllingefostre. Dette kunne tyde på, at Neurog3 muligvis er involveret i specifikationen af de forskellige endokrine celletyper ud over at inducere en generel endokrin skæbne i cellerne. Flere undersøgelser kræves dog for at underbygge denne hypotese.

Bindingspartneren E12 øgede ikke Neurog3s transkriptionelle aktivitet fra Neurod1 promotoren og øgede heller ikke Neurog3s evne til at inducere differentiering i det tidlige kyllinge tarmepitel. Derimod øgedes tendensen af de elektroporerede celler til at migrere. Dette var overraskende, når der sammenlignes med tidligere beskrevne studier, og det er uvist om denne observation er en direkte effekt af E12 eller om det skyldes en Neurog3-uafhængig effekt på endodermens celler. Observationen støtter imidlertid tidligere beskrevne studier, hvori Neurog3s evner til at inducere differentiering og migration beskrives som uafhængige. Den samme effekt af E12 på Neurog3 medieret differentiering og migration blev observeret for en af Neurog3 mutanterne identificeret i mennesker og i dobbeltmutanten. Disse mutanter havde reduceret DNA-binding. Myt1 blev identificeret som et direkte mål for Neurog3 transskription. Transkriptionsprofilen af de trunkerede Neurog3 proteiner var lidt anderledes fra Myt1 promotoren end fra Neurod1 promotoren, idet den N-terminale ende var nødvendig for at opnå samme transkriptionsniveau som for vildtypen. Det tydede også på, at trunkeringer fra den C-terminal ende havde en større effekt på responset fra Myt1 promoteren end fra Neurod1 promoteren. Selvom de var istand til at interagere, var de to Myt1 protein varianter fortrinsvis lokaliseret forskellige steder i cellen, med 6-zink finger formen i cytoplasma og 7-zink finger formen i kernen.

Undersøgelserne beskrevet i denne afhandling tyder på at Neurog3 har flere forskellige funktioner, og støtter de tidligere beskrevne observationer at Neurog3 induceret migration og differentiering er uafhængige processer. Neurog3 inducerer transskription af flere forskellige gener, også af transkriptionsfaktoren Myt1, som er et direkte mål for Neurog3. Det var uventet at bindingspartneren E12 ikke øgede Neurog3 medieret differentiering in vivo eller transkriptionel aktivitet in vitro. Et intakt bHLH domæne og aminosyrer i den region, der flankerer bHLH domænet på den N-terminale side er involverede i kernelokalisering. Det trunkerede Neurog3 protein, der mangler det N-terminale domæne, binder mere effektivt til DNA end Neurog3 vildtypen og kan inducere ectopisk insulinproduktion i endodermen af den tidlige tarm i kyllingefostre. Disse observationer kunne indikere at Neurog3 kan påvirke differentiering af de forskellige endokrine cellelinier udover at inducere en generel endokrin skæbne. En mere detaljeret forståelse af reguleringen og funktionen af Neurog3 vil give os en viden, der muligvis kan udnyttes i forbindelse med, at man ønsker en kontrolleret differentiering af stamceller til insulin producerende celler, der kan bruges til transplantering.

OriginalsprogEngelsk
Udgivelses stedBiologisk Institut
ForlagMuseum Tusculanum
Antal sider94
StatusUdgivet - 2009

Bibliografisk note

Akademisk vejleder: Olaf Nielsen

ID: 20168441